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    利用UHPLC-MS/MS評價(jià)SPE提取人體尿液中的阿片類(lèi)藥物

    更新時(shí)間:2021-03-25瀏覽:1385次

    背景

    任何固相萃?。?/span>SPE)或樣品制備方法開(kāi)發(fā)的目標都是獲得最-佳的分析物回收率,同時(shí)最-大程度地減少到達最-終分析樣品的污染化合物的濃度。傳統的松散填充SPE產(chǎn)品易受各種技術(shù)問(wèn)題的影響,如樹(shù)脂裝填不足所致。在方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中,不一致的填充可能會(huì )成為問(wèn)題,從而導致排空和通道化,從而增加了獲得不良分析物回收率的風(fēng)險。

    MicroluteTM CP SPE系列消除了制造過(guò)程中的松散包裝,克服了樣品制備過(guò)程中經(jīng)常遇到的常見(jiàn)技術(shù)問(wèn)題。取而代之的是,它由*的,固態(tài)的雜化聚合物結果組成,該結構由固定在固位介質(zhì)上的均勻分布的孔的互連網(wǎng)絡(luò )組成。這種設計可增強樣品的流通性,以最-大程度地提高分析物與固相之間的相互作用,從而提供高度可重復的SPE方法。

    本應用描述了使用強陽(yáng)離子交換(SCXSPE 30 mg 96孔微孔板的SPE LC/MS方法,用于測定人尿中的12種阿片類(lèi)藥物。它還檢查了雜化聚合物產(chǎn)品相對于散裝板的性能優(yōu)勢。

    介紹

    阿片類(lèi)藥物危機

    阿片類(lèi)藥物被認為是緩解疼痛最-有效的藥物,被歸類(lèi)為減輕患者痛苦的重要部分[1].。這類(lèi)藥物在止痛方面的功效,也被用于娛樂(lè )目的而引起很多爭議。因阿片類(lèi)藥物使用的正?;?,而導致*對它們廣泛成癮和濫用。據估計,歐洲在2017[2]130萬(wàn)高風(fēng)險使用者,而美國2018 [3]年估計有1030萬(wàn) 12歲以上的人濫用阿片類(lèi)藥物。

     

     隨著(zhù)阿片類(lèi)藥物濫用的增加,在實(shí)驗室檢測阿片類(lèi)藥物的存在變得更為重要,用以幫助發(fā)現濫用阿片類(lèi)藥物的患者,同時(shí)仍使其他患者正常使用阿片類(lèi)藥物緩解疼痛。實(shí)驗室測試對于幫助解決美國的阿片類(lèi)藥物危機起著(zhù)關(guān)鍵作用。Quest診斷人員(美國國家大型臨床實(shí)驗室)分析了其2011年至2017年藥物測試數據,其中包含了390萬(wàn)個(gè)身份不明的藥物檢測測試。該報告指出,從2011年至2017年,每年進(jìn)行的大多數測試均被歸類(lèi)為與規定量的預期結果不一致。因此,可以從這些結果中得出結論,需要進(jìn)行測試以確認患者是否正在濫用處方或將其他非法藥物與處方一起使用。如果患者按照處方使用阿片類(lèi)藥物或無(wú)視他們的計劃并導致濫用,則可以通過(guò)色譜尿液藥物測試來(lái)進(jìn)行最-終驗證。

    阿片類(lèi)藥物的檢測

    目前有兩種檢測尿樣阿片類(lèi)藥物的方法:一種免疫分析篩選測試和一種色譜測試。標準的阿片類(lèi)藥物免疫測定通常設計用于檢測天然嗎-啡樣分子(嗎-啡和可待-因),但不能檢測到諸如芬-太-尼和美-沙-酮之類(lèi)的合成阿片類(lèi)藥物。使用色譜技術(shù)的優(yōu)勢在于可以通過(guò)一種方法識別所有不同的阿片類(lèi)藥物,以針對不同的類(lèi)別。它還提供了樣品中每個(gè)阿片類(lèi)藥物的定量結果,而不是定性免疫分析結果。

    其他測定尿液中阿片類(lèi)藥物的技術(shù)包括色譜法“dilute and shoot,該方法涉及用內標溶液稀釋樣品并直接注入LC-MS系統。但是,與固相萃?。?/span>SPE)方法相比,它不能濃縮樣品。由于尿樣中經(jīng)常存在少量的阿片類(lèi)藥物,這可能會(huì )導致加陰性,尤其是在質(zhì)譜儀上反應不強烈的阿片類(lèi)藥物。SPE還可以從尿液樣品中去除“dilute and shoot”中存在的任何基質(zhì)成分。這些會(huì )影響阿片類(lèi)藥物的電離并在MS離子源中積累,導致結果不可靠。還將導致更長(cháng)的測試交付時(shí)間,昂貴的重新測試以及更長(cháng)的儀器維護時(shí)間。

    本應用簡(jiǎn)報展示了如何將SCX混合模式SPE方法與UHPLC-MS/MS相結合使用,以可靠,可重復的方式分析人尿液樣品中的12中天然,半合成和合成阿片類(lèi)藥物和代謝物。

    化合物

    嗎-啡,羥-嗎-啡-酮,去-甲-羥-考-酮,氫-可-酮,去-甲-氫-可-酮,O-去-甲-基-順-式-曲-馬-多,降-芬-太-尼,順-式-曲-馬-多,哌-啶,芬-太-尼,E-D-D-P,美-沙-酮。 所有化合物均以1 mg / mL的形式從Cerilliant購買(mǎi)。

    樣品制備

    在甲醇中制備了所有阿片類(lèi)物質(zhì)(3ug/ml)的儲備液。為了制備尿液樣品,將12.5ml混合來(lái)源的混合性別的空白人尿加入625ul阿片樣物質(zhì)儲備溶液。通過(guò)向12.5ml尿液中加入625 µL甲醇來(lái)制備空白。樣品和空白均用1%甲酸的水溶液以11稀釋?zhuān)u旋1分鐘以使溶液均質(zhì)。

    對于混合模式SPE,MicroluteCP SCX 30 mg 96孔板的每個(gè)孔(目錄號PSCX030P-001)用1,000 µL甲醇調理,然后用1,000 µL水平衡。將每個(gè)預處理的樣品和空白樣品*加到孔板中。上樣后,用1,000 µL0.1%甲酸水溶液洗滌每個(gè)孔,然后加入1,000 µL0.1%甲酸甲醇溶液。 每個(gè)孔用2 x 400 µL 45:45:10脫甲醇/乙腈/ TEA洗脫。在室溫下,使用帶有直針的96針頭(目錄號229036)和 氮吹儀MiniVap Gemini(目錄號500234)在N2下蒸發(fā)洗脫至干燥,大約需要45分鐘。在100 µL起始流動(dòng)相(水中0.1%甲酸)中重構樣品。峰值后標準由100 µL在起始流動(dòng)相(0.1%甲酸的水溶液)中稀釋的阿片樣物質(zhì)標準溶液(1500 ng / mL)重建空白溶液孔。在市售的散裝96孔板上也進(jìn)行了相同的操作(圖1)。

    結果與討論

    色譜法

    150 ng / mL校準標準品中所有化合物的色譜圖如圖2所示。色譜圖的峰分配可以在表1中找到。

    LC方法始于100%的水溶液,以確保在進(jìn)樣開(kāi)始之前先洗脫洗脫溶液中仍可能存在的鹽和最-具極性的組分,然后再從色譜柱上洗脫任何阿片類(lèi)藥物。這防止那些化合物干擾阿片樣物質(zhì)的電離。

    第/一個(gè)要洗脫的阿片類(lèi)藥物峰是3.60分鐘的嗎啡,最后一個(gè)峰是7.71分鐘的美-沙-酮。 除氫-可-酮及其代謝物去-氫-可-酮以外,所有峰均被分離(化合物4,5)。由于前體離子的不同,這意味著(zhù)沒(méi)有信號干擾。

    1中列出了分析的12種阿片類(lèi)藥物和代謝物。在整個(gè)化合物范圍內,極性各不相同:對于去甲-羥-可-待-酮,親水性最-強的LogP值為0.70;對于E-D-D-P,最疏水性的LogP值為5.20。 所有分析的化合物均為弱堿,pKas范圍為8.2-10.1,這意味著(zhù)SCX(強陽(yáng)離子交換)樹(shù)脂是最-適合捕獲和生產(chǎn)干凈樣品并注入LC-MS系統的SPE樹(shù)脂。

    回收率和再現性

    此應用使用100 µL的重組量,這導致加到孔板上的1 mL尿液濃度達到原來(lái)的10倍。這樣可以提高所分析每種化合物的靈敏度。 SPE的過(guò)程通過(guò)將分析物與樹(shù)脂結合,同時(shí)洗掉尿液基質(zhì)中存在的干擾化合物,從而幫助創(chuàng )建了一種更清潔的溶液-高水位洗滌液以清除任何極性化合物,并用甲醇洗滌液洗脫疏水性酸性和中性干擾物。當從SPE產(chǎn)品中洗脫樣品時(shí),這兩種清洗方法有助于創(chuàng )建非常干凈的溶液,從而在洗脫步驟時(shí)將干擾降至最-低。

    使用MicroluteCP SCX 96孔板進(jìn)行樣品制備后,測量加到人尿液中的12種化合物中每種化合物的回收率。圖3顯示了從尿樣加標樣品前樣品制備物中回收的所有化合物的平均回收率,大小為12個(gè)重復樣品中的所有化合物。除哌-啶和E-D-D-P外,所有阿片類(lèi)藥物的回收率均大于80%。

    使用與MicroluteCP SCX板上相同的方法,將回收率與市售30 mg散裝產(chǎn)品進(jìn)行比較。兩種產(chǎn)品的比較結果見(jiàn)圖4。與雜化聚合物相比,松散填充產(chǎn)品的回收率表明每種分析物的回收率都有所下降。提出這種減少是由于雜化聚合物的結構,該結構在分析物和色譜介質(zhì)之間提供了更有效的相互作用。結果,整個(gè)MicroluteCP SCX板的整體上減少了分析物和溶劑的通道效應。

    導流是液體沿著(zhù)阻力最-小的路徑通過(guò)SPE床的過(guò)程。因此,當尿液加到孔板上,由于穿過(guò)SPE床的流動(dòng)路徑不均勻,它可能無(wú)法與所有存在的樹(shù)脂*相互作用。這有效地降低了產(chǎn)品的負載能力,并可能破壞分析物,導致回收率低。第二個(gè)問(wèn)題是洗脫時(shí),與雜化聚合物的洗脫量相比,溶劑與結合的分析物的接觸較少,這可能導致回收率降低,并且需要更大的洗脫量。

    孔間可重復性是衡量96孔板不同孔之間每個(gè)回收結果彼此之間有多接近的一種度量。這是確保對所收集結果有信心的一項重要措施。如果記錄的重現性很低,可能會(huì )對收集的結果產(chǎn)生懷疑。對于方法驗證,重要的指標是查看建議的指導原則以及可接受的級別。色譜生物分析測定法通常在LODLOQ水平[12、13、14]時(shí),其RSD指標<15%或<20[12、13、14]。這是一項非常重要的測試方法,您需要像阿片類(lèi)藥物測試那樣放心,這可能會(huì )對接受測試的患者造成重大后果。

    5顯示了回收率結果的%RSD。數據顯示%RSD值范圍從嗎-啡的1.39%到E-D-D-P5.95%。這些數字表明,這12個(gè)重復的重現性很好地落入了通常用于方法驗證的%RSD指南的典型建議限值內。

    概括

    Microlute™ CP SCX能夠檢測尿液中的各種阿片類(lèi)藥物,包括天然,半合成和合成化合物,使其成為濫用藥物分析的明顯選擇。SPE的過(guò)程允許樣品濃縮,從而可以對較低濃度的樣品進(jìn)行更/靈敏的分析。對于‘dilute and shoot’方法,這是不可能的,因為該方法的核心原理是稀釋樣品。Microlute™ CP SCX微孔板還可以在不同類(lèi)別的阿片類(lèi)藥物范圍內提供有利的回收率,重現性低于RSD值的10%。這樣可以確保產(chǎn)品提供可靠和可重復的結果,這是在藥物測試中需要對數據輸出充滿(mǎn)信心的重要指標。

    References:

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